Connaisez vous un peu de biotech? Non? Bon, moi j’y passe la journée à faire des trucs catalogués de science-fiction pour des gens non connaisseurs.
Pour ma thèse, j’ai besoin d’une grande quantité d’une metallothioneine, un type de proteine qui est capable de s’unir à des metaux lourds. Pour avoir cette proteine, il y a deux moyens. Le premier est prendre l’organisme en question, le gonfler à metaux lourds (cadmium, mercure…) et, une fois la pauvre bête est morte, purifier la proteine. Bien sur, celà peut poser un tout petit problème étique selon l’organisme à étudier.. imaginons s’il s’agit de l’home!
Donc, il fait longtemps, jadis, un deuxième méthode a été mis en place: clonnation de bacteries qui vont produire cette proteine recombinante en grande quantité. Et touer des milions de bacteries, celà ne pose des soucis à personne.
Et c’est ce deuxième méthode que je fais: je prepare des bacteries qui sont capables d’exprimer en grande quantité un gène d’un animal vachement plus grand (non, ce n’est pas d’une vache!). Comment on fait celà? Oh, c’est facile! D’abord, on prend le gène désirée, on fait une PCR, qui est une technique que permet d’amplifier exponentiellement la quantité de copies du gène. Tout suite, on coupe les extremités dans des endroits qu’on a dejà dessiné avec la PCR. Cette coupure permet que les deux cotés de la sequence soient cohésif, c’est à dire, collants. Celà aide à la ligation de notre gène avec le vecteur d’expression. Un vecteur d’expression est une molécule d’ADN circulaire qu’on va introduir dans la bacterie et qui va nous permetre d’induire l’expression du gène cloné, et donc la production en grande quantité de la porteine codé par ce gène. Il nous reste maintenant que transformer les bacteries avec ce vecteur d’expression qui porte le gène desirée, et preparer de grandes cultures bacterienes d’où on va purifier la proteine.
C’est facile, non? Et, bon, non. Une fois le protocole est absolutement mis en place, on peut avoir la bacterie clonée en 5 jours, plus ou moins. Mais il y a plein trucs qui vont faire retarder le résultat de temps et de temps, et de temps, et de temps..et..
D’abord, il faut optimiser la PCR. Il y a plein facteurs qui affecten le résultat: dès les concentrations des différents produits utilisés au bon dessin des amorces. Les amorces sont des petits morceaux d’ADN qui vont s’unir aux extremités de la sequence à amplifier pour permettre à la polymerase commencer à copier. Dans mon cas, une partie des amorces est extactement le début ou la fin du gène de ma proteine, mais une autre part sert à introduire une cible pour pouvoir couper et avoir les extremes cohésifs.
Après plusieurs essais, une fois la quantité de Mg optimisée, ainsi que le temps de PCR, cycles, quantité de buffer, polymerase, ADN … bref, après une journée d’essai (avec de la chance), on est prêts pour preparer une PCR pour avoir ce qu’on nomme l’INSERT, parce que c’est le gène qui va s’inserer au vecteur.
Là j’aimerai avoir une web cam pour vous regarder: les biologistes on suivi, les autres celà fait un moment qui se sont perdus, voir arreter de lire.. et même, parmi les connaisseurs, il y en a qui vont me corriger?
Bon, voilà la premiere journée de boulot: on laisse tourner la PCR définitive overnight et le lendemain matin on va continuer nos manips. Et je laisse aussi mon post ici, histoire de pas être trop lourde!
