Dans un de mes derniers post j’ai expliqué un peu n’importe comment ce que je fais pour commencer un clonage de proteines. Depuis ce jour, j’ai reçu plusieures questions qui m’ont permis de voir que le niveau était un peu trop haut pour la plus part des gens qui m’ont lu. Donc, j’ai décidé de repondre à une question assez repetée: Quest-ce que c’est une PCR?
La técnique de la PCR (de l’anglais Polymerase Chain Reaction) a été décrite l’année 1986, par Kary Banks Millis (Prix Nobel en Chimie le 1993). Cette téchnique permet d’obtenir une grande quantité de copies d’un fragment d’ADN grâce à l’enzyme DNA polymerase, qui peut copier (repliquer) une chaîne simple d’ADN en partant d’une region en double chaîne.
Qu’est-ce qu’on a besoin pour celà?
- ADN “moule”: C’est la sequence d’ADN qu’on veut amplifier. Il est en double chaîne. Dans mon cas, il s’agit de la partie d’expression du gène de la metallothioneine que je veux étudier, qui se trouve dans un vecteur.
- Primers ou amorces: Sont des oligonucleotides (petits fragments d’ADN) qui ont été dessinés de façon qu’ils vont nous servir pour déterminer la partie à amplifier parmi la totalité du ADN “moule”. Ils sont complementaire à la chaîne originale d’ADN, et, en plus, on y ajoute une cible pour un enzyme de restriction. Cette cible nous permetra plus tard de cloner le produit de cette PCR dans un plasmide.
- Taq polymerase: enzyme termostable qui copie la partie desirée. Il y en a plein types différents, vendus comercielement.
- dNTP: desoxynucleotides tri-phosphate. C’est le substract necessaire pour polymeriser l’ADN nouveau: dATP, dCTP, dGTP et dTTP. Sont les 4 bases ou composants de l’ADN et que la Taq placerà un derrier l’autre en suivant la sequence moule.
- MgCl2: des ions de Magnesium, un cofacteur necessaire pour l’enzyme. Il faut bien calculer la bonne concentration parce que s’il y en a trop, l’efectivité diminue. On va travailler à la concentration minimale parce que celà augmente l’especificité de la réaction.
- Buffer ou tampon: solution qui maintien le pH stable pour la bonne marche de la polymerase.
- Eau ultra pure (miliQ).
La PCR est une repetition d’un cycle qui a trois pas: dénaturalization, hybridation et elongation. Pendant la dénaturalization, l’ADN moule, qui est une double chaîne, va s’ouvrir du à l’haute temperature (95ºC). Ceci est un pas très important, parce que si la dénaturalization n’est pas complète, la quantité de produit finale est beaucoup plus basse.
Tout suite, on fait descendre la temperature, qui permet la rénaturalization du DNA, et c’est en ce moment là que les amorces vont hybrider à ces endroits complèmentaires. La température d’hybridation varie en fonction des caracteristiques des amorces utilisés. Une température haute permetrà une hybridation plus spécifique, parcontre, une température trop basse nous donnera des produits inspécifiques.
Au dernier pas, la température monte jusqu’àux niveaux optimes de travail de l’enzyme (entre 70 et 75ºC), de façon que la polymerase peut commencer à copier à partir de l’amorce et repliquer l’ADN. Ce troisième pas peut être plus ou moins long selon la longitude du fragment à amplifier. On considère que pour 1000 bp on a besoin d’environ un minute de temps.
Ces trois pas sont répétés 25-35 fois, de façon a obtenir une grande quantité d’ADN. L’amplification est exponentielle: d’une copie, à la fin du premier cycle, on en a 2, après, 4, 8, 16, 32…
Une fois les cycles terminés, on laisse un dernier pas d’elongation qui va durer plusieurs minutes et qui permetra à la polymerase de finir complètement.
Bon, j’espère que j’ai éclairci un peu ce que c’est cette téchnique. Si vous voulez voir une animation très pédagogique, je vous envoie au site de l’Université Pierre et Marie Curie de Paris: http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/index.htm
Bientôt, je continuerai la suite des métodes pour cloner et explimer une proteine.
Mais les amorces sont consommées au fur et à mesure (en gros il faut une amorce pour une copie de ton gragment d’ADN si j’ai bien compris). Comment obtiens tu ton paquet d’amorces initial (car il en faut un paquet, c’est ça qui doit limiter la croissance exponentielle à mon avis non?)
Oui, t’as bien compris. Mais celà serait aussi le cas de la quantité de dNTPs qu’on y met, et aussi la quantité d’enzyme (il faut compter un enzyme par chaîne à copier).
En realité les quantités qu’on met de ces produits sont largement suffisantes pour finir la réaction et qu’il en restent.
Si tu me demandes comment je fais pour avoir une grande quantité d’amorces, ben, comme pour l’enzyme, on les achette à des boîtes spécialisés. On peut commander une sequence spécifique de 20-30 bases, c’est à dire, un amorce et on reçoit un poudre au point pour hydrater et en avoir une quantité suffisante pour jamais en finir. J’ai jamais eu besoin de redemander le même amorce parce qu’on a fini le stock.
Ces amorces sont syntetisés, ils proviennent pas d’une PCR si c’est celà qui t’avais passé dans le sprit. Malheureusement je ne connais pas suffisant la thécnique de syntese artificielle d’amorces pour pouvoir t’expliquer mieux.
J’ai compris
(du moins je crois bien…)